亮点或者创新之处

本文将CRISPR-Cas12a系统与MRS传感相结合，构建基于CRISPR-Cas12a系统的MRS生物传感器检测沙门氏菌。充分利用MNPs作为磁分离工具和信号标签的双重功能，为生物传感器的设计提供了新思路。同时，得益于CRISPR-Cas12a系统的高特异性和MRS检测的高灵敏度，该生物传感器对沙门氏菌具有良好的检测性能。

核心结论

构建基于CRISPR-Cas12a的MRS生物传感器检测沙门氏菌。引入小粒径的MNPs作为磁信号探针，开发MNPs产生信号的新功能。该生物传感器通过CRISPR-Cas12a系统在目标物存在下对biotin-S₁的切割作用控制两种不同粒径MNPs的结合，然后利用大小粒径MNPs磁分离速度的差异，以溶液中游离的小粒径MNPs为信号输出分子检测沙门氏菌。得益于CRISPR-Cas12a系统的高特异性和高效切割活性以及MRS检测方法的高灵敏度，该生物传感器对纯菌液和鸡肉提取液加标样品中沙门氏菌的LOD分别为1.3×10² CFU mL^-1和1.8×10³ CFU mL^-1，且可避免重复磁分离与洗涤，操作更为简便。

研究背景

MNPs可作为MRS传感检测中的磁性探针。传统的基于MNPs聚集/分散状态改变的MRS生物传感方法易受样品基质干扰，稳定性较差。基于MNPs数量变化的MRS生物传感器已经得到了较好的发展。但是以上方法需要目标物自身提供位点以控制大小粒径MNPs之间的结合。目标物的表面位点有限且可能发生非特异性结合，因而检测灵敏度会受到影响。为此，本文将CRISPR-Cas12a系统与MRS传感技术相结合，利用CRISPR-Cas12a系统精准控制两种不同粒径MNPs之间的结合，开发基于CRISPR-Cas12a的MRS生物传感器检测沙门氏菌。

实验方案或者实验材料

如图1所示，分别在粒径为130 nm和30 nm左右的MNP130和MNP30表面修饰SA和S2，制得SA修饰的MNP130（MNP130-SA）和S2修饰的MNP30（MNP30-S2）探针。当目标物存在时，Cas12a、crRNA和靶标DNA形成三元复合体，并激活trans切割活性以非特异性切割biotin-S1。因此，MNP30-S2无法通过S1和S2之间的碱基互补配对作用结合至MNP130-SA表面，在磁场作用下仍分散在溶液中。反之，大量MNP30-S2结合至MNP130-SA表面，并在磁场作用下被分离。最后，以清液中游离的MNP30-S2为探针，通过横向弛豫时间T2的测定检测沙门氏菌。

图1

bat365核磁助力：利用低场核磁设备（PQ001，bat365电子科技有限公司，上海，中国）测量获得样品的横向弛豫时间T₂。在测定T₂时，仪器的温度精确设置为32±0.01°C。利用硬脉冲序列Q-FID校准仪器中心频率O1及寻找90^o射频脉宽P1和180^o脉宽P2。然后，利用Carr-Purcell-Meiboom-Gill（CPMG）脉冲序列进行T₂的测量。

结果分析

1：利用TEM表征MNP₁₃₀-SA在有无目标物存在下的表面状态。如图2A所示，MNP₁₃₀-SA的粒径为130 nm左右；而MNP₃₀-S₂的粒径在30 nm左右。在无目标物存在下，MNP₁₃₀-SA捕获biotin-S₁，并与MNP₃₀-S₂结合，因此MNP₁₃₀-SA表面结合了大量MNP₃₀-S₂。而当目标物存在下，Cas12a/crRNA复合体的trans切割活性被激活，使biotin-S₁被非特异性切割，从而影响MNP₁₃₀-SA与MNP₃₀-S₂之间的结合。因此MNP₁₃₀-SA周围仅有极少量MNP₃₀-S₂的存在。以上TEM表征结果证明了该生物传感器检测S. Typhimurium具备可行性。

图 2

2：考察切割方式对检测效果的影响。即方案1：先将biotin-S₁偶联至MNP₁₃₀-SA表面制得MNP₁₃₀-S₁，然后利用CRISPR-Cas12a系统切割MNP₁₃₀表面的S₁；方案2：切割溶液中游离的biotin-S₁，然后加入MNP₁₃₀-SA进行捕获。采用方案1时，利用肉眼观察分散性变化即可实现目标物的定性检测，简单方便，但是灵敏度较低；而采取方案2则可显著提高MRS生物传感器对目标物的响应。为提高检测灵敏度，在后续实验中继续采取方案2的切割方式检测沙门氏菌。

图 3

3：从图4可以看出，1.3×10² CFU mL^-1细菌浓度下的T₂值已低于阈值线，说明该方法可对1.3×10² CFU mL^-1的S. Typhimurium进行检测，其LOD明显低于大部分已报道的MRS生物传感器。对鸡肉提取液加标样品中的S. Typhimurium进行检测。该方法对鸡肉提取液中S. Typhimurium的LOD为1.8×10³ CFU mL^-1。将纯菌液和鸡肉提取液中的检测结果进行对比发现，鸡肉提取液中10³ CFU mL^-1细菌引起的信号响应明显高于纯菌液（ΔT₂%分别为10%和47%）。为评估该生物传感器对沙门氏菌的特异性，选取S. aureus、E. coli O157:H7、V. parahaemolyticus和L. monocytogenes四种常见食源性致病菌作为考察对象。S. Typhimurium和四种非目标菌的浓度均为10⁵ CFU mL^-1。如图所示，相较于空白对照，非目标菌引起的信号变化率均在5%以内，而目标物S. Typhimurium则可引起60%以上的信号下降，体现了该生物传感器良好的特异性。

图 4

结论

本文提出了一种基于CRISPR-Cas12a系统的MRS生物传感器检测沙门氏菌。该方法利用CRISPR-Cas12a系统控制两种不同粒径MNPs的结合，并以游离的小粒径MNPs为磁性探针实现MRS信号输出，对纯菌液和鸡肉提取液加标样品中S. Typhimurium的LOD分别为1.3×10² CFU mL^-1和1.8×10³ CFU mL^-1。该方法充分利用了MNPs作为磁分离载体和信号标签的双重功能。此外，检测磁分离后的清液省去了繁琐的重复洗涤操作，简化了检测步骤。通过设计特定的crRNA，该方法亦可拓展至其他目标物的检测，具备一定的通用性。

该研究工作得到了国家自然科学青年基金，沃尔玛基金会和沃尔玛食品安全协作中心的的资助与支持。